組氨酸標簽蛋白親和純化介質(zhì)過濾層析法

組氨酸標簽蛋白親和純化介質(zhì)過濾層析法 Ni IDA Beads填料

      Ni IDA Beads可以用于各種表達來源（如大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞）的組氨酸標簽（6xHis-tagged）蛋白的純化。它是以4%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過化學方法偶聯(lián)了三配位的亞氨基二乙酸（IDA），螯合鎳離子（Ni2+）后，可以形成比較穩(wěn)定的平面四邊形結(jié)構(gòu)，從而有更多的位點與組氨酸標簽上的咪唑環(huán)繼續(xù)配位，達到結(jié)合目的蛋白的效果。但是，這樣的結(jié)構(gòu)比較容易受到其他小分子的進攻，鎳離子易被還原或者被螯合，從而破壞其化學結(jié)構(gòu)，無法結(jié)合目的蛋白。Ni IDA Beads具有載量高，性能和價值匹配等優(yōu)點。

表1. Ni IDA Beads產(chǎn)品性能

2.純化流程

2.1 緩沖液的準備

可使用下列推薦緩沖液，也可根據(jù)自己的使用習慣配置不同的緩沖液體系，基本原理就是低咪唑上樣，高咪唑洗脫。緩沖液在使用前盡量用0.22 μm 或者0.45 μm 濾膜過濾除菌。具體配置方法見表2。

組氨酸標簽蛋白親和純化介質(zhì)過濾層析法 Ni IDA Beads填料純化蛋白流程：

2.2.1 細菌或酵母表達的蛋白

1）挑取單菌落到培養(yǎng)基中，根據(jù)載體使用說明，加入相應(yīng)濃度的誘導劑誘導相應(yīng)的時間。

2）表達結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中，7，000 rpm（7，500×g），離心15min 收集菌體，然后按照菌體∶Lysis Buffer=1∶10（WNV）加入

Lysis Buffer，加入終濃度為 1mM的 PMSF。加入溶菌酶（工作濃度為 0.2-0.4 mg/ml，如果表達的宿主細胞內(nèi)含 pLysS 或 pLysE，可以不加溶菌酶），同時也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與樹脂的結(jié)合）。

3）將菌體沉淀懸浮起來，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10 ug/ml RNase A和5 μg/ml DNase I），混勻，放置于冰上，然后冰上超聲破碎細胞，至菌液基本保持澄清。

4）將澄清的破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中，10，000 rpm（15，000×g），4℃離心 20-30 min。取上清，置于冰上備用或-20℃保存。

2.2.2 酵母、昆蟲和哺乳細胞分泌表達可溶性蛋白

1）將細胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心杯，5.000 rpm（3.800×g）;離心10min，收集菌體得上清，如上清中不含 EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì)，即可直接加入柱子使用;如含有 EDTA、組氨酸和還原劑等物質(zhì)，需用Lysis Buffer 透析才能加入柱子。2）對于大量體積的上清，需加入硫酸銨沉淀濃縮后，蛋白還需用 Lysis Buffer 透析后才能加入柱子。

2.3 Ni IDA Beads 重力柱的裝填

1）取合適規(guī)格的重力層析柱，裝入下墊片，加入適量純水潤洗柱管和墊片，關(guān)閉下出口。

2）將 Ni IDA Beads 混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中（介質(zhì)實際體積占懸液的一半），打開下出口流干保護液。

3）加入適量純水沖洗介質(zhì)，待柱管中液體重力流干后，關(guān)閉下出口。

4）裝入潤洗后的上墊片，確保墊片與填料之前沒有空隙，且保持水平。

5）裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進行平衡，暫不使用時則加入保護液，4-30℃保存。

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