流式細胞儀是一種用于細胞分析的實驗室儀器，它能夠對單個細胞進行快速而精確的定量和質量分析。它主要通過將細胞懸浮液注入到儀器中，利用激光器照射細胞并檢測經(jīng)過細胞的光線散射和熒光信號，從而獲取大量有關細胞形態(tài)、大小、復雜度、表面標記以及內部分子的信息。它可同時測量多個參數(shù)，并具備高通量性能，能夠快速分析數(shù)以萬計的細胞，并提供詳細的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)。它廣泛應用于免疫學、細胞生物學、藥理學、腫瘤學等領域的研究和實驗中。
然而，在分析流式細胞儀得到的熒光結果時，常常會遇到一些問題，如信號強度弱、背景高、細胞群分布異常等。本文將介紹常見問題，并提供相應的解決方法。
一、信號強度弱
1. 信號補償不正確：檢查流式細胞儀上的單色陽性對照是否設置正確，并確保門控和補償設置正確。
2. 用于檢測的抗體不足：增加抗體的量或濃度。
二、熒光強度高
1. 抗體濃度過高：減少每個樣本中添加的抗體量。
2. 過量抗體被捕獲：洗滌步驟要充分，并在洗滌緩沖液中加入吐溫或Triton，以保持細胞的透化作用。
3. 封閉不足：在抗體混合液中加入1%-3%的封閉劑，并增加封閉步驟。
三、背景高/陽性細胞百分比高
1. 增益設置過高/補償過低：使用陽性對照正確設置流式細胞儀，并使用補償減少小顆粒背景信號和降低增益。
2. 抗體過量：降低抗體的濃度，并在洗滌緩沖液中加入去污劑，確保洗去過量的抗體。
四、在應該只有一個細胞群的情況下觀察到兩個或多個細胞群
1. 表達靶蛋白的細胞群不止一個：檢查樣本中包含的細胞類型預期的蛋白表達水平，并確保細胞充分分離。
2. 出現(xiàn)細胞雙峰：細胞雙峰顯示為第二大細胞群，其熒光強度大約是單細胞熒光強度的兩倍。在染色前用移液槍將細胞輕柔混勻，并在細胞儀中運行之前再次混勻。
五、側向散射背景偏高（來自小顆粒）
1. 細胞裂解：確保樣本中的細胞沒有裂解和破碎，樣本應新鮮并正確制備，避免高速離心或激烈渦旋的操作。
2. 細菌污染：確保樣本不受細菌污染，細菌會自動發(fā)出較弱的熒光，導致高事件率。
六、低事件率
1. 每毫升的細胞數(shù)過少：將細胞稀釋至1×105至1×106個細胞/mL，確保細胞均勻混合。
2. 細胞聚集阻塞管道：在染色前輕柔吹打幾次，確保得到同源單細胞懸液，也可以篩選或過濾細胞，去除團塊。
七、高事件率
1. 細胞數(shù)量過多：稀釋樣本至1×105至1×106個細胞/mL。
通過以上問題及解決方法，我們可以更好地分析流式細胞儀得到的熒光結果。然而，需要注意的是，不同實驗條件可能會導致不同的問題和解決方法。因此，根據(jù)實際情況，選擇合適的解決方案是很重要的。同時，定期檢查和維護流式細胞儀，以確保其正常運行，也是避免問題發(fā)生的重要措施。
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