丙酮酸羧化酶是細(xì)胞質(zhì)和線粒體代謝途徑的重要元素，可以有效促進(jìn)能量代謝。在 CHO 細(xì)胞中過表達(dá)酵母胞質(zhì)丙酮酸羧化酶 (PYC2)，可 以增加丙酮酸流向 TCA 循環(huán)。增強(qiáng)的 PYC2 表達(dá)導(dǎo)致丙酮酸通量增加，從而使乳酸積累減少多達(dá) 4 倍，并顯著增加細(xì)胞密度和培養(yǎng)壽命。有了這個結(jié)果，與親本細(xì)胞相比，工程細(xì)胞的抗體表達(dá)顯著提高了 70%，產(chǎn)品質(zhì)量也有所提高（約 3 倍）。通過 PYC2 工程 改造提升細(xì)胞性能，在丙酮酸、葡萄糖、乳酸和細(xì)胞能量代謝方面具有均高于親代細(xì)胞的各種優(yōu)勢。
PYC2 工程改造原理和方法
在補(bǔ)料分批上游工藝中，產(chǎn)生抗體的 CHO 細(xì)胞需要持續(xù)提供碳、氮、能量 (ATP) 和還原劑 (NADPH) 以維持其合成代謝功能。 由于培養(yǎng)基消耗糖酵解過程會產(chǎn)生乳酸和氨等不需要的廢物，這些物質(zhì)積累，會阻礙細(xì)胞生長以及重組產(chǎn)品的產(chǎn)品質(zhì)量屬性。
糖酵解是葡萄糖被氧化的主要分解代謝途徑，最后，一分子葡萄糖轉(zhuǎn)化為兩分子丙酮酸，然后進(jìn)入線粒體并在 TCA 循環(huán)中被氧化。CHO 細(xì)胞在補(bǔ)料分批模式下的細(xì)胞代謝需要高速率的糖酵解，從而觸發(fā)丙酮酸的積累。由于線粒體和胞質(zhì)代謝系統(tǒng)的連通性差，大部分積累的丙酮酸通量驅(qū)動乳酸脫氫酶 (LDH) 產(chǎn)生乳酸. 乳酸的測定一般使用EKF Biosen C-Line 來進(jìn)行葡萄糖乳酸分析。
迄今為止，已經(jīng)嘗試了多種方法來使用生產(chǎn)宿主的代謝工程或細(xì)胞培養(yǎng)過程的過程工程來減少細(xì)胞培養(yǎng)廢物。比如使用半乳糖或丙酮酸替代葡萄糖，或用天冬酰胺或谷氨酸替代谷氨酰胺。調(diào)節(jié)細(xì)胞系統(tǒng)代謝途徑中涉及的酶來減少廢物積累也是一種不錯的選擇。
PYC2 工程改造是通過在哺乳動物細(xì)胞 BHK 和 HEK293 細(xì)胞中表達(dá)胞質(zhì)酵母丙酮酸羧化酶 2 (PYC2) 基因來減少乳酸積累，從而增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量或改善細(xì)胞生長， 實(shí)驗(yàn)證明，在 CHO 細(xì)胞中過表達(dá) PYC2 可以延長細(xì)胞培養(yǎng)時間，并將乳酸/葡萄糖比率降低 25%，但是，比生產(chǎn)率降低 50%，從而影響整體體積抗體表達(dá)。主要方法是通過 PYC2 改造的細(xì)胞庫的異源群體中篩選 PYC2 改造的 CHO 克隆。隨后，根據(jù)培養(yǎng)性能及其代謝特征從 PYC2 克隆組中選擇單細(xì)胞克隆?；诟鞣N生化和代謝分析，建立了一個代謝控制的 CHO 平臺，該平臺具有增強(qiáng)的 PYC2 基因負(fù)載，并且能夠在較高的細(xì)胞密度、高葡萄糖消耗率和降低的乳酸的分批補(bǔ)料過程中維持較長時間積累。
PYC2 工程的細(xì)胞庫生成和細(xì)胞系開發(fā)
為了增強(qiáng)細(xì)胞代謝并改善細(xì)胞溶質(zhì)和線粒體代謝途徑，我們通過增加 CHO 細(xì)胞池中的 PYC2 基因負(fù)荷來改造 CHO 細(xì)胞系統(tǒng)。在這項(xiàng)研究中，我們使用密碼子優(yōu)化（針對 CHO）酵母丙酮酸羧化酶 (PYC2) 基因，該基因在 CHO 細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中表達(dá)。PYC2 通過將細(xì)胞溶質(zhì)丙酮酸驅(qū)向代謝途徑的克雷伯循環(huán)，在控制丙酮酸積累方面發(fā)揮關(guān)鍵作用"。增加表達(dá)代謝優(yōu)化 PYC2 基因的基因拷貝可有效觸發(fā)丙酮酸流向線粒體代謝途徑，并將糖酵解與 TCA 循環(huán)聯(lián)系起來，以增強(qiáng)內(nèi)部細(xì)胞能量代謝。
通過使用氖電穿孔法，用帶有 PYC2 基因的質(zhì)粒 pMPYC 轉(zhuǎn)染 CHO-S 細(xì)胞（懸浮液），并產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞庫。為了從轉(zhuǎn)染池中篩選出所需的 CHO 克隆，我們應(yīng)用了兩階段選擇方案，其中我們使用不同濃度的選擇劑嘌呤霉素和 MTX 生成了轉(zhuǎn)染的 CHO 細(xì)胞群. 選擇壓力從低濃度逐漸增加到高濃度，通過消除源自高度異質(zhì)性群體的不良細(xì)胞/克隆，可以嚴(yán)格選擇所需的細(xì)胞庫。選定的池具有混合的轉(zhuǎn)染 PYC2-CHO 細(xì)胞群，這些細(xì)胞含有不同的 PYC2 基因拷貝，并且還由于隨機(jī)整合事件以及 CHO 基因組中的位置效應(yīng)而改變 PYC2 表達(dá)模式。為了評估每個池的代謝性能，我們進(jìn)一步選擇了池 1B、1C 和 2D 來評估 PYC2 表達(dá)效率，隨后使用 CD-Forti-CHO 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和nest搖瓶進(jìn)行了補(bǔ)料分批培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中評估了代謝特征（乳酸和葡萄糖），細(xì)胞活力和生長模式從細(xì)胞周期的指數(shù)期到穩(wěn)定期，并將幾個重要參數(shù)與親代 CHO 細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染）進(jìn)行了比較。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
通過觀察，pool 1B（選自 Phase I，含有 200nM MTX 和 20ug/ml Puromycin），pool 1C（選自 phase II，含有 500nM MTX 和 30ug/ml Puromycin）和 pool 2D（選自 phase II，含有1000nM MTX 和 50ug/ml Puromycin）在細(xì)胞活力和細(xì)胞密度分布方面顯示出它們之間以及與親代 CHO 細(xì)胞的顯著差異。在池 1B 中，達(dá)到的峰值細(xì)胞密度高達(dá) 2000 萬個細(xì)胞/mL，但是，細(xì)胞活力從第 10 天開始下降，并在第 14 天達(dá)到約 72%，而池 1C 顯示細(xì)胞密度高達(dá) 2300 萬個細(xì)胞/mL，并且活力從第 11 天開始下降，并在同一天（第 14 天）達(dá)到約 83%。相比之下，從最高濃度的選擇劑中選出的 2D 池顯示出顯著延長的細(xì)胞活力以及池中最高的細(xì)胞密度（圖 1B 和 1C）。在池 2D 中，達(dá)到的峰值細(xì)胞密度約為 2600 萬個細(xì)胞/mL，第 14 天的細(xì)胞活力約為 92%，比包括親代 CHO 細(xì)胞在內(nèi)的其他兩個池（圖 1B 和 1C）高10-20 %，如上所述. 此外，我們分析了細(xì)胞在乳酸積累和消耗率方面的代謝行為，發(fā)現(xiàn)與其余池和親代細(xì)胞相比，2D 池在乳酸代謝方面存在顯著差異。池 2D 和 1C 以及池 1B 和親代 CHO 細(xì)胞的乳酸譜彼此相似，但是，池 2D 的乳酸產(chǎn)量顯著降低（圖 1D）與其他細(xì)胞池相比。由于這些池具有不同 PYC2 基因負(fù)載的異質(zhì)細(xì)胞群，并且在補(bǔ)料分批培養(yǎng)期間，異質(zhì)群的累積效應(yīng)顯示細(xì)胞活力、密度和乳酸譜的變化，因此我們選擇 2D 池作為后續(xù)池的最終池單細(xì)胞克隆、篩選和建立潛在的工程細(xì)胞候選者。單細(xì)胞分選是使用 Guava® Muse-細(xì)胞分析儀通過為活的和良好的邊緣/邊緣細(xì)胞形狀設(shè)置有效門控來進(jìn)行的（圖 1E）。細(xì)胞分選在白色背景下進(jìn)行，不使用任何標(biāo)記試劑/抗體。分選的單細(xì)胞最初在 384 孔板中生長，并通過使用 ZenCELL innoME 活細(xì)胞動態(tài)成像分析儀在從第 0 天到第 17 天的不同時間間隔進(jìn)一步監(jiān)測它們的生長模式（圖1F）。根據(jù)細(xì)胞/克隆的形態(tài)、生長和克隆性，我們挑出那些僅來源于單個細(xì)胞的菌落（通過細(xì)胞成像儀確認(rèn)），然后將選定的菌落轉(zhuǎn)移并從低體積逐漸擴(kuò)大到高體積按照材料和方法（ 圖 1E 和 1F）中的描述，進(jìn)入多孔板，然后進(jìn)入 T-25 燒瓶 . PYC2 克隆 #12 的克隆穩(wěn)定性研究還在補(bǔ)充有 6mM 谷氨酰胺（搖瓶）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 CD-Forti-CHO 中進(jìn)行了 70 代，有和沒有選擇壓力，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性長達(dá) 50 代。
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