藥物傳遞系統(tǒng)DDS：是將脂質(zhì)體、微囊、微球、微乳、納米囊、納米球、外泌體等作為藥物載體將藥物通過不同的給藥方式，直接輸送到病灶部位的一種新型醫(yī)療方式。
將藥物加載到外泌體
在進(jìn)行藥物傳遞系統(tǒng)DDS設(shè)計時，其中一個重要的環(huán)節(jié)就是載藥方法。由于外泌體具有生物相容性、穩(wěn)定性和腫瘤靶向性，隨著外泌體技術(shù)研究的不斷發(fā)展 使它們成為有前景的藥物載體。外泌體的構(gòu)建類似于雙膜脂質(zhì)體，并且藥物裝載方法也類似。但在藥物傳遞系統(tǒng)DDS設(shè)計前需要根據(jù)藥物和外泌體特性仔細(xì)選擇。
外泌體可以通過被動或主動方法裝載多種藥物、大分子和其他物質(zhì)（ 圖 3）。被動方法比較簡單，它是基于藥物與外泌體或細(xì)胞孵育，并進(jìn)一步分離含有藥物的釋放外泌體（ 圖 3 I、II）。這種方法通過不同的藥物濃度梯度來實現(xiàn)；因此，在與外泌體孵育期間，物質(zhì)本身也 會遷移到囊泡中。這一過程可以通過施加額外的力來加強(qiáng)，例如搖動或攪拌等.
被動裝載法的缺點(diǎn)是裝載效率低，輸出藥物濃度低（約 1%）。將藥物與外泌體或其他 DDS 載體一起孵育是一種較常見并 且簡單的方法，尤其適用于疏水性藥物。
主動加載方法可以實現(xiàn)更高的加載效率，包括超聲處理 (可達(dá)~28%)、電穿孔 (~5%) 、擠壓、凍融、pH 梯度 (1.7%) 和結(jié)合方法。具體方法是通過超聲處理和電穿孔在 外泌體膜上穿孔，再分別由聲波或電脈沖介導(dǎo)（ 圖 3 III、IV）。之后，外泌體將通過上述試劑誘導(dǎo)的小膜孔從溶液中加載藥物。這些方法似乎不會改變外泌體膜的特性，但會導(dǎo)致外泌體大小增加。
主動加載法的另一種方法是通過抗體或點(diǎn)擊化學(xué)將藥物與外泌體結(jié)合?？贵w將通過它們對外泌體結(jié)構(gòu)元素的親和力非共價結(jié)合到外泌體表面（ 圖 3七). 化學(xué)合成將導(dǎo)致藥物通過例如 PEG 或膜蛋白與外泌體共價結(jié)合，并且進(jìn)一步釋放取決于外泌體降解。這些方法還可以通過將特定受體引入膜來將外泌體靶向所需細(xì)胞 。
圖 3. 將藥物裝入外泌體的方法。
( I )—從藥物暴露細(xì)胞中釋放的載藥外泌體，
( II )— 藥物與外泌體孵育并攪拌，
( III )—超聲處理，
( IV )—電穿孔，
( V )— 擠出，
( VI )—凍融循環(huán)，
( VII )-藥物與外泌體的化學(xué)綴合。
以上步驟中提到的方法允許根據(jù)藥物的親水性和親脂性將藥物摻入外泌體或磷脂雙層的內(nèi)部。親水性物質(zhì)將滲透于外泌體的腔內(nèi)，而可溶于脂質(zhì)的物質(zhì)將聚集在外泌體的膜上（ 圖2）。一些研究報告證明，親水性物質(zhì)很容易加載到外泌體中，而親脂性物質(zhì)的加載效率較低。通常，這些物質(zhì)在體外 24 小時內(nèi)從外泌體釋放約 50% 。
選擇藥物加載方法時需要考慮到對外泌體結(jié)構(gòu)和特性的影響。目前，通過電穿孔的聚集和融合法使用較為普遍。
實際上，外泌體作為細(xì)胞間信號傳遞分子可以遞送多種物質(zhì)，包括化療藥物（紫杉醇、多柔比星和紫杉醇）、RNA 和 DNA等 。另外，近年來還針對細(xì)菌（弓形蟲病和沙門氏菌?。?、病毒（艾滋病和乙型肝炎）、癌癥（肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、腦癌和乳腺癌）等進(jìn)行基于外泌體的疫苗開發(fā)設(shè)計。所以外泌體也常被用作基因編輯工具遞送的工具 ，例如 Cas9.
給藥途徑
根據(jù)目前的研究，外泌體主要通過靜脈內(nèi)給藥，位置主要為肝臟肺和腦、胃中，只有少數(shù)研究使用另一種給藥方法，即經(jīng)鼻、口服和腹膜內(nèi)給藥。
表 4. 外泌體的藥物、大分子和潛在靶向策略示例。
| 外泌體的藥物方法和給藥途徑 |
| 藥物/大分子 | 加載效率和方法 | 起源 | 靶向細(xì)胞/組織 | 影響 |
| 紫杉醇 | 1.4%；逆轉(zhuǎn)錄孵育；5.3%；電穿孔；28.3%；輕度超聲處理 | RAW 264.7 細(xì)胞系 | Madin–Darby 犬腎 MDCK WT和 MDCK MDR1細(xì)胞，小鼠 Lewis 肺癌細(xì)胞亞系 (3LL-M27) | 多重耐藥細(xì)胞系的細(xì)胞毒性增加超過 50 倍。 |
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| 阿霉素 | 7.4%；超聲處理和隨后的擠壓 | 4T1細(xì)胞系 | MCF-7細(xì)胞系 | 近紅外激光觸發(fā)的多柔比星從用 Fe 3 O 4修飾的外泌體中釋放。 |
| 阿霉素 | 6.5%；超聲處理 | 雄性 KM 小鼠的小鼠骨髓 | 斑馬魚，攜帶 C6-Luc 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的小鼠 | 快速血腦屏障穿越和腦積聚。靶向：浸潤性腦腫瘤細(xì)胞。 |
| hsa-miR148a-3p | 無損檢測；化學(xué)轉(zhuǎn)染（Lipofectamine 2000） | 牛奶 | HepG2、Caco-2細(xì)胞系 | 具有成本效益的外泌體來源。時間依賴性細(xì)胞摻入。 |
| 紫杉醇 | 8%；逆轉(zhuǎn)錄孵育 | 牛奶 | 裸鼠肺腫瘤異種移植 | 腫瘤生長抑制。與靜脈內(nèi)給藥相比，全身和免疫原性毒性較低 |
| 紫杉醇 | 14%；藥物孵育細(xì)胞 | 來自臍帶的 MSC | A549、SK-OV-3、MDA-hyb1細(xì)胞系；NODscid 小鼠的 MDA-hyb1 乳腺腫瘤 | 與含有紫杉醇的外泌體相比，使用高 1000 倍濃度的游離紫杉醇可減少癌癥的生長和轉(zhuǎn)移。 |
| 埃拉斯汀 | 3.2 毫克 erastin/毫克蛋白質(zhì)；超聲處理 | HFL-1細(xì)胞系 | MDA-MB-231細(xì)胞系 | 用于靶向遞送、促進(jìn)鐵死亡、減少增殖和癌細(xì)胞遷移的葉酸標(biāo)記外泌體。 |
| CRISPR/Cas9 質(zhì)粒 DNA | 來自 MSC 的外泌體的化學(xué)轉(zhuǎn)染（Exo-Fect™ 外泌體轉(zhuǎn)染試劑盒）； |
| KPC689 | 成功破壞胰腺癌細(xì)胞中的Kras G12D致癌等位基因。抑制增殖和腫瘤生長 |
| CRISPR/Cas9 質(zhì)粒 DNA | 細(xì)胞 (HEK293T) 的化學(xué)轉(zhuǎn)染 (Lipofectamine 2000) 和從條件培養(yǎng)基中分離外泌體 | HEK293T細(xì)胞系 | 細(xì)胞系 |
| PEI 基質(zhì)中靶向 KRAS 的 siRNA； | >90%；與 PEI 基質(zhì)孵育； | 牛初乳 | H1299、A549、H522、Panc-1、MiaPaCa-2細(xì)胞系；體內(nèi) A549 異種移植模型 | 抑制腫瘤生長和 KRAS表達(dá)。在 p53-null H1299 細(xì)胞中誘導(dǎo) p53 的表達(dá)。 |
| 編碼 p53 的質(zhì)粒 DNA | <5%；電穿孔； |
| 35% 用 Exo-Fect™ 進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)染（約 35%） |
| 阿霉素; 膽固醇修飾的 miRNA159 | 74.5–160.6 ng/μg 外泌體；在三乙胺溶液中孵育；1.2% 的 miRNA，5.3% 的膽固醇修飾的 miRNA | THP-1細(xì)胞系 | MDA-MB-231細(xì)胞系 | 外泌體的靶向特性，對癌細(xì)胞的協(xié)同治療作用，抑制生長和運(yùn)動。TCF-7 基因的沉默。 |
| 5-氟尿嘧啶；miR-21抑制劑寡核苷酸 | 3.1%；0.5%；電穿孔 | 293T細(xì)胞系 | HCT-116 SFR細(xì)胞系；體內(nèi) BALB/c 裸鼠 | 成功共遞送、細(xì)胞中 miR-21 的下調(diào)、周期停滯的誘導(dǎo)、增殖減少、耐藥性逆轉(zhuǎn)、5-FU 細(xì)胞毒性增加、體內(nèi)腫瘤生長減少 |
| miR-31-5p | 不適用；電穿孔 | 牛奶 | HUVEC細(xì)胞系；體內(nèi) BALB/c 小鼠 | 體外細(xì)胞功能改善，血管生成增強(qiáng)，糖尿病小鼠體內(nèi)傷口愈合 |
| CD47 和 SIRPα 抗體 | 通過 pH 敏感接頭與外泌體表面綴合 | RAW264.7細(xì)胞系 | RAW264.7細(xì)胞系，體內(nèi)BALB/C小鼠 | 靶向 CD47 表達(dá)細(xì)胞，改善巨噬細(xì)胞吞噬作用，外泌體重編程巨噬細(xì)胞抗癌活性 |
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| galectin-9 siRNA，奧沙利鉑 | 半乳糖凝集素9、13.17% 馬來酰亞胺-硫醇偶聯(lián)物的 13.17% N/A 電穿孔 | 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 | PANC-02細(xì)胞系，體內(nèi)C57BL/6小鼠，SD大鼠 | 顯著的抗癌活性，提高巨噬細(xì)胞腫瘤抑制活性，增加細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞的募集 |
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| 小檗堿 | 17.13%，超聲處理 | 原代巨噬細(xì)胞 | C57BL/6J小鼠 | 巨噬細(xì)胞抗炎和抗凋亡 M2 表型的誘導(dǎo)，脊髓損傷后小鼠運(yùn)動的改善 |
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| Erastin、Rose Bengal、CD47 表面標(biāo)記的外泌體 | 60%、84% 的包封率，超聲處理；CD 47 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的供體細(xì)胞 | HEK293T細(xì)胞系 | RAW264.7 Hepa1-6 細(xì)胞系，體內(nèi) C57BL/6 | 阻止外泌體吞噬作用，激光照射后體內(nèi)和體外鐵死亡誘導(dǎo)，外泌體肝腎細(xì)胞毒性降低 |
| miR-138-5p | 慢病毒轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞 | 脂肪來源的干細(xì)胞 | T24，5637細(xì)胞系，體內(nèi)BALB/C裸鼠 | 膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲減少，抑制體內(nèi)腫瘤生長 |
近些年，外泌體研究領(lǐng)域發(fā)展迅速，來新型外泌體分離技術(shù)實現(xiàn)了從小體積樣品中快速、高效、精確地分離，在外泌體研究也取得了許多重大進(jìn)展，這些都使外泌體成為納米藥物、基因要等創(chuàng)新藥的遞送工具。外泌體技術(shù)的發(fā)展 對于未來的外泌體的檢測、生物標(biāo)志物篩選以及癌癥的鑒別等也都具有重要的意義。
選擇外泌體作為給藥載體的主要優(yōu)勢在于它可以降低藥物濃度，能夠準(zhǔn)確到病灶部位有效提高效率并減少藥物的毒副作用。盡管如此，外泌體的載藥效率仍有提升空間。比如：在外泌體研究領(lǐng)域中，由于不同供體細(xì)胞分離的外泌體特性也是不同的，需要足夠了解與熟悉各種外泌體的 特性，了解外泌體的長期毒性、免疫原性和安全性這也是外泌體藥物傳遞系統(tǒng)DDS設(shè)計的重點(diǎn)。
蘇州阿爾法生物專注于生物實驗室儀器和生物試劑、實驗室耗材行業(yè)14年。所提供的納米粒度儀、熒光顯微鏡等廣泛應(yīng)用于細(xì)胞外泌體研究領(lǐng)域。另外，提供的實驗室設(shè)備包括發(fā)酵罐、生物反應(yīng)器、細(xì)胞培養(yǎng)搖床、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、PCR儀、乳酸分析測定儀等也廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)實驗。
