實時熒光pcr檢測利用熒光分析法用特定結(jié)合DNA的染料來測定DNA的濃度。常用的DNA染料包括 溴化乙錠、Hoechst33258、SYBR Green I 和 II、SYBR Gold 及 PicoGreen。
溴化乙錠
溴化乙錠含有三環(huán)菲嚏平面環(huán)系統(tǒng)，可嵌入到雙鏈DNA堿基之間。嵌入DNA雙螺旋 后，溴化乙錠的菲嚏環(huán)平面位于與螺旋軸相垂直的位置，并通過范德瓦耳斯力與上下堿基 結(jié)合。而其平面環(huán)系統(tǒng)被埋在底部，其外側(cè)的苯基和乙烷基處于DNA雙螺旋的大溝內(nèi)。 在高強度離子溶液的飽和狀態(tài)，大約每2.5個堿基對嵌入一分子的溴化乙錠，這與DNA的 堿基組成無關(guān)。溴化乙錠的嵌入一般不會對堿基對的構(gòu)象及其在螺旋中的位置產(chǎn)生影響， 除了會使堿基對沿螺旋軸移位3.4A (Waring 1965)。這種移位可造成飽和溴化乙錠的DNA 分子長度增加 27% 。
溴化乙錠還可以高度可變計量學與RNA和熱變性或單鏈DNA形成的鏈間堿基對結(jié)合 (Waring 1965, 1966； Lepecq and Paoletti 1967)?溴化乙錠平面基團的固定位置及其與堿 基的密切接近可使結(jié)合的染料散發(fā)的熒光比游離在溶液中的染料要強20-25倍O 254nm的 紫外線(UV)照射由DNA吸收，并轉(zhuǎn)移至溴化乙錠；302nm和366nm的紫外線照射由溴 化乙錠本身吸收。在590nm和可見光的紅-黃區(qū)一小部分(約0.3)可被重新釋放出來(Lepecq and Paoletti 1967 ； Tuma et al. 1999)?
大多數(shù)銷售的UV光源可發(fā)射302nm的UV光。溴化乙錠-DNA復合物在此波長產(chǎn)生 的熒光明顯強于366nm，但略微低于較短的波長(254nm)。然而，DNA分子的光漂白和 斷裂作用在302nm要比在254nm處低得多。
溴化乙錠主要用于檢測瓊脂糖中的DNA,但 這種染料也還可以用于半定量地估算DNA溶液的濃度。
▲在酵母及沙門氏菌中，溴化乙錠本身并不容易誘發(fā)突變，但它通過微粒體酶代謝的化合物可中度誘變，多數(shù)研究所開發(fā)了安全操作及處理含有 溴化乙錠溶液及膠的說明。研究者應該根據(jù)這些說明來處理溴化乙錠。安全處理溴化乙錠的試劑盒也可通過Schleicher & Schuell和Qbiogene 公司及其他渠道獲得。
Hoechst 33258
Hoechst 33258是一類雙-苯并咪哩熒光染料，可高特異性非插入地結(jié)合于DNA雙鏈的 小溝。結(jié)合的染料產(chǎn)生的熒光從0.01 ±升到0.6 ,因此，Hoechst 33258用于雙鏈DNA溶液的熒光檢測及定量。Hoechst 33258比溴化乙錠更優(yōu)先使用，因 為它具有非常強的區(qū)分雙鏈DNA與RNA及單鏈DNA的能力。
與其他非嵌入染料類似, Hoechst 33258可優(yōu)先結(jié)合DNA螺 旋中的富含A/TK(Weisblum and Haenssler 1974),并隨著A+T含量的增加，熒光強度以 10的對數(shù)增長= Hoechst 33258與雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生的熒光比與單 鏈DNA結(jié)合要強3倍左右。
SYBR Green I
SYBR Green I (Life Technologies)是一種嵌入型青藍色染料，在488nm藍色光照射激 發(fā)后，在522nm (綠光)具有發(fā)射高峰。盡管SYBR Green I可加入到凝膠上樣緩沖液中， 但并不推薦這樣使用，因為該染料對DNA在凝膠中的遷移影響很大。為得到好的效果， 凝膠應該進行預染處理。由于產(chǎn)生的熒光很強，SYBR Green I是一種可用于檢測少量DNA
(低拷貝/PCR產(chǎn)物數(shù)量少)的理想染料。少至20pg的DNA或250pg多分散性DNA在經(jīng) 過SYBR Green I染色后，凝膠可用基于CCD的圖像記錄系統(tǒng)進行檢測。
因為SYBR染料-DNA復合物在非極性溶液中可解離，因此可用乙醇沉淀的方法將 SYBR Green I 從 DNA 中去除。
SYBR Green II
SYBR Green II (Life Technologies)主要用于對電泳后的RNA和單鏈DNA進行染色。 由于該染料在結(jié)合RNA后發(fā)出非常亮的熒光及其在凝膠中的低背景，SYBR Green II經(jīng)常 用來對多聚甲醛/瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠中的RNA進行染色。
利用肝臟提取物進行Ames實驗顯示SYBR染料與溴化乙錠相比致癌性要低(Singer et aL 1999)。但SYBR Green在暴露于UV的細菌中比溴化乙錠更容易誘發(fā)突變(Ohta et al. 2001 )o Life Technologies公司現(xiàn)在銷售更安全的SYBR染料(SYBR-Safe DNA凝膠染色) (見 Martineau et al. 2008)。
SYBR Gold
SYBR Gold (Life Technologies)是檢測凝膠中DNA和RNA高度靈敏的染料，與300nm 紫外光源和基于CCD的圖像記錄系統(tǒng)聯(lián)合使用。結(jié)合DNA后，SYBR Gold在495nm和 300nm處均有大激發(fā)(發(fā)射波長可達537nm)。
結(jié)合核酸后，SYBR Gold的熒光增強程度是溴化乙錠的30多倍。SYBR Gold染凝膠 中DNA的靈敏度是SYBR Green I的10多倍，染乙醛酸化的RNA的靈敏度是溴化乙錠的 25倍以上。
SYBR Glod也可用于檢測甲基敏感的單鏈構(gòu)象分析(MS-SSCA) (McKee and Thomson 2004)0然而，由于其成本較高，SYBR Gold并不是檢測凝膠中DNA或DNA定量的常規(guī) 選擇染料。Ames實驗顯示SYBR Gold并不具有誘變作用(Kirsanov et al. 2010),并且不像 其他菲嚏類染料如溴化乙錠，SYBR Gold可很容易地通過乙醇沉淀法從DNA中去除。
PicoGreen
PicoGreen (Life Technologies)是一種耐光性染料，在480nm處有*大激發(fā)，在520nm 處有發(fā)射高峰，可特異結(jié)合雙鏈DNA。在檢測溶液中雙鏈DNA時，其具有高靈敏度和 大動力性范圍。PicoGreen廣泛應用于多孔板DNA樣品的自動化檢測和定量。利用一個 染料濃度，可檢測1?1000ng/mL的DNA樣品，并可通過手持型熒光分析儀進行精確定量 。
將染料從DNA中去除
在推薦使用濃度范圍內(nèi)，SYBRGreen I和SYBR Gold并不顯著抑制限制酶、連接酶及 熱穩(wěn)定DNA聚合酶的活性。這些染料不像溴化乙錠和其他菲嚏類染料，可非常容易通過 乙醇沉淀法從DNA中去除。
溴化乙錠染DNA后可抑制后續(xù)酶促反應中DNA作為模板或底物的能力。幸運的是， 溴化乙錠可通過兩次等體積的異丙醇或酚：氯仿(25 : 1)萃取，非常容易并快速地從DNA 中去除。去染色的DNA可再通過乙醇沉淀回收。
實際上，所有用于純化DNA的商業(yè)試劑盒或系統(tǒng)都可有效地將溴化乙錠及其他DNA 結(jié)合染料從DNA中去除。
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