使用EBV 表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的方法？

EBV，也稱(chēng)為人類(lèi)皰疹病毒 4，是淋巴隱病毒屬的一種伽馬皰疹病毒. 它是傳染性單核細(xì)胞增多癥的原因，并與多種人類(lèi)腫瘤疾病有關(guān)，包括伯基特淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。大多數(shù)成年人的 EBV 血清反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明其在人群中普遍存在。感染通常是潛伏的。然而，外植的淋巴瘤細(xì)胞有時(shí)會(huì)產(chǎn)生傳染性病毒。幾十年前，來(lái)自淋巴瘤外植體的細(xì)胞系的上清液被用于確認(rèn) EBV 感染的腫瘤潛力，這是通過(guò)病毒介導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)中人血 B 淋巴細(xì)胞的永生化。從那時(shí)起，B 淋巴細(xì)胞的 EBV 體外轉(zhuǎn)化已成為獲得用于診斷和研究人類(lèi)細(xì)胞系的常規(guī)程序。

一、實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備：

1.二甲基亞砜 (DMSO)

2. 培養(yǎng)基

 IMDM、RPMI-1640、胎牛血清

3.抗生素

青霉素/鏈霉素溶液，10,000 IU/mL 青霉素，10,000 μg/mL 鏈霉素 ( ATCC 30-2300 )

4.PBS緩沖液，不含鈣和鎂

5.來(lái)自 EBV 表達(dá)細(xì)胞的過(guò)濾上清液

6.經(jīng)輻照的 MRC-5 貼壁細(xì)胞

注意：經(jīng)輻照的 MRC-5 細(xì)胞包裝為冷凍懸浮液，每瓶 1 毫升。每個(gè)小瓶足以接種高達(dá) 225 cm 2的表面積（9 - T-25 燒瓶）

二、生物實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備

凍存管

去纖維蛋白或抗凝劑處理的全人血

Histopaque-1077 Ficoll 梯度溶液或Sigma-Aldrich 

25 cm 2 (T-25) 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)處理

75 cm 2 (T-75) 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)處理

15 mL 無(wú)菌聚苯乙烯離心管，帶蓋

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏褂肊BV 制劑 轉(zhuǎn)化您的B 淋巴細(xì)胞從而獲得 VR-1492。

實(shí)驗(yàn)時(shí)的注意事項(xiàng)：

所有工作都應(yīng)在 BSL-2 條件下使用無(wú)菌技術(shù)完成，并使用處理血液制品的通用預(yù)防措施。B95-8 細(xì)胞還可能攜帶和分泌一種可傳播的 D 型逆轉(zhuǎn)錄病毒，松鼠猴逆轉(zhuǎn)錄病毒 – B95-8 (SMRV-B95-8)，它可以感染人類(lèi) B 和 T 細(xì)胞系。這種逆轉(zhuǎn)錄病毒不會(huì)干擾 EBV 的轉(zhuǎn)化能力。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.將 0.1 mL DMSO 分配到標(biāo)記的冷凍管中用于血液儲(chǔ)存。

2.從容器中匯集去纖維蛋白或抗凝劑處理過(guò)的血液。

3.每個(gè)凍存管分配 0.9 mL 的血液，定期混合以確保均勻的細(xì)胞懸浮液。蓋上小瓶并輕輕混合。

4.在 -80°C 的乙醇中將小瓶冷凍在冷凍保存容器中 3-18 小時(shí)，或以每分鐘 1°C 的速度冷凍。

5.將冷凍保存的血液小瓶?jī)?chǔ)存在液氮中。

6.在用于轉(zhuǎn)化前 1-5 天準(zhǔn)備飼養(yǎng)層。

7.通過(guò)將 FBS 添加到 EMEM 或 IMDM 到 10% v/v 和青霉素/鏈霉素溶液到 1% v/v (1X) 來(lái)制備完整的培養(yǎng)基。

8.解凍一瓶經(jīng)輻照的 MRC-5 單層細(xì)胞，并在無(wú)菌 50 mL 錐形管中與 27 mL 完整培養(yǎng)基混合。

9.每個(gè) T-25 燒瓶（~4 × 10 5 個(gè)  細(xì)胞）分配 3 mL 細(xì)胞懸浮液。 

10.第二天用顯微鏡檢查培養(yǎng)瓶。理論上應(yīng)該是大約 30% 重合。

注意：培養(yǎng)后1-5天用于轉(zhuǎn)化。

淋巴細(xì)胞處理步驟：

1.準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞

2.將 3 mL 的全血（新鮮或解凍）與等體積的 PBS 或 RPMI-1640 混合。

3.使用 Ficoll 從紅細(xì)胞和粒細(xì)胞中分離淋巴細(xì)胞。

4.在 15 mL 聚苯乙烯離心管中，將稀釋的全血小心地鋪在 4.5 mL 的室溫 Histopaque-1077 上。

5.在室溫下以 400 × g 離心 40 分鐘。

6.取出并丟棄上層透明等離子層，使其距離中間層0.3 cm 2以?xún)?nèi)。

7.將中間層的不透明淋巴細(xì)胞帶和 Histopaque-1077 層轉(zhuǎn)移到管底部顆粒的0.3 cm 2 內(nèi)，轉(zhuǎn)移到新的 15 mL 離心管中。

8.用含 20% FBS 和青霉素/鏈霉素的 IMDM 填充管；將試管充分混合并以 260 × g 離心 15 分鐘。取出并丟棄上清液

9.用 10% FBS 和青霉素/鏈霉素在 10 mL IMDM 中重新懸浮細(xì)胞顆粒；以 260 × g 離心 15 分鐘，混合并收集細(xì)胞。取出并丟棄上清液。

10.用 10% FBS 和 1X 青霉素 /鏈霉素在 3 mL IMDM 中重新懸浮細(xì)胞顆粒。

11.使用染料排除方法對(duì)所得淋巴細(xì)胞制劑進(jìn)行可行計(jì)數(shù)。

12.立即使用細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化或?qū)⑺鼈兝鋬鲆詡鋵?lái)用于全血。

三、設(shè)置轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物（建議每個(gè)樣品使用 2 個(gè)培養(yǎng)瓶） 

1.每個(gè)轉(zhuǎn)化瓶解凍 1 瓶人類(lèi) gammaherpesvirus 4 (HHV-4) ( VR-1492) (1 mL) 。 

2.從飼養(yǎng)層中取出培養(yǎng)基。

3.  每瓶需要添加：2 毫升 IMDM 與 20% FBS；1 mL 淋巴細(xì)胞懸液，含有 1-6 × 10 6淋巴細(xì)胞；1 毫升（1 瓶）人伽馬皰疹病毒 4 (HHV-4) (ATCC VR-1492)。

4.在 5% CO 2濃度下， 37°C 混合培養(yǎng)，持續(xù)觀(guān)察轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)物

5.啟動(dòng)后 7 天，觀(guān)察每個(gè)燒瓶的轉(zhuǎn)化跡象并添加 4 mL 新鮮培養(yǎng)基（ IMDM，含 20% FBS 和 1X 青霉素/ 鏈霉素）。

6.淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的早期跡象包括錐形細(xì)胞、具有尖峰狀突起的細(xì)胞和具有折射性的、看起來(lái)健康的細(xì)胞簇。

7.轉(zhuǎn)化的后期跡象包括培養(yǎng)物的濁度增加和培養(yǎng)基的酸化，表現(xiàn)為變黃。

8.此后每 3-4 天，檢查培養(yǎng)物是否有轉(zhuǎn)化跡象并添加新鮮培養(yǎng)基。

9.小心地取出 3-4 毫升培養(yǎng)基而不去除細(xì)胞。

10.加回相同體積的*培養(yǎng)基（含 20% FBS 和 1X 青霉素 /鏈霉素的 IMDM）。

11.擴(kuò)大轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物以建立淋巴母細(xì)胞系

12.將細(xì)胞從密集的 T-25 搖瓶瓶轉(zhuǎn)移到 T-75 搖瓶，并添加足夠的 IMDM 和 10% FBS 和青霉素/鏈霉素，以獲得每毫升 1-3 × 10 5細(xì)胞的細(xì)胞密度。

13.通過(guò)添加培養(yǎng)基，將 T-75 搖瓶中的細(xì)胞密度保持在每毫升1-3 × 10 5 個(gè)細(xì)胞。

14.擴(kuò)展到額外的燒瓶以將細(xì)胞密度保持在 1-3 × 10 5細(xì)胞/mL。

15.以每毫升3-5 × 10 6 個(gè)細(xì)胞的速度冷凍轉(zhuǎn)化細(xì)胞以供保存和以后使用

16.完成活細(xì)胞計(jì)數(shù)以確定懸浮液中細(xì)胞的密度和活力以及保留待冷凍的細(xì)胞總數(shù)。

17.通過(guò)以 260 × g 離心 15 分鐘從培養(yǎng)液中收集細(xì)胞。

18.丟棄上清液并將細(xì)胞顆粒重新懸浮在一定體積的冷凍冷凍介質(zhì)中（IMDM，含 10% FBS 、青霉素/鏈霉素和 10% DMSO），細(xì)胞密度為每毫升3-5 × 10 6 個(gè)細(xì)胞。

19.將產(chǎn)生的細(xì)胞懸浮液分配到標(biāo)記的冷凍管中。

20.將小瓶在乙醇中的冷凍保存容器中在 -80°C 下冷凍 3-18 小時(shí)，或以每分鐘 1°C 的速度在受控速率冰箱中冷凍，然后將它們儲(chǔ)存在液氮中。

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