微生物菌種保存方法

標(biāo)簽：微生物 微膠囊 

  微生物應(yīng)用技術(shù)在細(xì)胞工廠以及研究各種生物過(guò)程實(shí)驗(yàn)中起著重要作用，但是微生物的保存以及微生物培養(yǎng)的連續(xù)性一直是微生物應(yīng)用領(lǐng)域的難題。實(shí)踐證明，與在平板或發(fā)酵罐中連續(xù)傳代培養(yǎng)微生物培養(yǎng)物相比，建立微生物庫(kù)可以輕松實(shí)現(xiàn)微生物儲(chǔ)存和檢索。

根據(jù)儲(chǔ)存時(shí)間的長(zhǎng)短和微生物的種類(lèi)，一般會(huì)采用不同的保存方法。長(zhǎng)期保存的主要原理是保持微生物長(zhǎng)期處于休眠狀態(tài)，免受污染及遺傳變化，直到使用時(shí)使其恢復(fù)生機(jī)。這種方法通常是通過(guò)使用低溫和冷凍或干燥技術(shù)來(lái)減少細(xì)胞代謝活動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。近年來(lái)，還有一種新型微生物保存技術(shù)是微膠囊化保存法，主要用于保存益生菌。

短期存儲(chǔ)（持續(xù)增長(zhǎng)）

微生物的連續(xù)生長(zhǎng)可以在瓊脂培養(yǎng)基上維持很短的時(shí)間。微生物的瓊脂平板培養(yǎng)物在實(shí)驗(yàn)室冰箱 (4°C) 中可存活數(shù)周，而細(xì)菌培養(yǎng)物可在 4°C 下作為瓊脂刺培養(yǎng)物保存長(zhǎng)達(dá)一年。大多數(shù)微生物（細(xì)菌、真菌和藻類(lèi)）都可以使用這種方法儲(chǔ)存，推薦用于經(jīng)常使用的培養(yǎng)物。使用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些培養(yǎng)物不斷生長(zhǎng)，盡管在較低溫度下生長(zhǎng)速度較慢，使它們能夠在可用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用下存活更長(zhǎng)時(shí)間。

為了盡量減少瓊脂的污染和干燥，培養(yǎng)板應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室薄膜牢固地包裹起來(lái)并倒置存放（瓊脂面朝上）。在瓊脂培養(yǎng)基上短期儲(chǔ)存的主要優(yōu)勢(shì)是微生物容易回收。使用時(shí)，只需將它們劃線(xiàn)到新鮮的培養(yǎng)板上或?qū)⑺鼈兘臃N到液體培養(yǎng)基中并在最佳生長(zhǎng)溫度下孵育！

然而，隨著時(shí)間的推移，瓊脂會(huì)變干，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)被微生物耗盡。代謝廢物也會(huì)累積到有毒水平。營(yíng)養(yǎng)缺乏和有毒廢物的積累最終會(huì)導(dǎo)致儲(chǔ)存的微生物死亡。

A. 使用直線(xiàn)將單個(gè)細(xì)菌菌落放入一瓶軟瓊脂中，然后孵育形成瓊脂刺培養(yǎng)物。B.細(xì)菌在瓊脂培養(yǎng)基板上劃線(xiàn)并孵育。

長(zhǎng)期儲(chǔ)存

對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，微生物在低于冰點(diǎn)（-20°C、-80°C 或液氮）的溫度下冷凍保存或冷凍干燥（凍干）。冷凍保存適用于范圍廣泛的細(xì)菌、藻類(lèi)、真菌、病毒和原生動(dòng)物。超低溫會(huì)大大降低酶活性，從而降低微生物的代謝過(guò)程。為防止冰晶形成對(duì)細(xì)胞造成損害，在 -20°C、-80°C 或液氮 (-196°C) 下儲(chǔ)存之前，將細(xì)胞重新懸浮在含有冷凍保護(hù)劑（如甘油）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中?；蛘撸?xì)胞也可以在冷凍前重新懸浮在脫脂牛奶中 。為了最大限度地提高回收率，建議在細(xì)胞濃度最高的生長(zhǎng)靜止期冷凍培養(yǎng)物。大多數(shù)培養(yǎng)物可以在 -20°C 的低溫小瓶（圖 2）中儲(chǔ)存至少一年，一些細(xì)菌原液在 -80°C 和液氮中儲(chǔ)存時(shí)仍可存活數(shù)十年！冷凍微生物可以通過(guò)在 37°C 下解凍并接種到新鮮培養(yǎng)基中而復(fù)活 。

上圖（微生物置于凍存管中）

冷凍干燥（凍干）通過(guò)在真空中將水轉(zhuǎn)化為冰來(lái)去除冷凍樣品中的水分，從而阻止微生物代謝過(guò)程并將細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干燥的顆粒，以便在安瓿中儲(chǔ)存和運(yùn)輸（圖 3）。冷凍干燥已被用于保存細(xì)菌、藻類(lèi)、酵母、病毒和孢子形成真菌 。然而，凍干不適用于某些細(xì)菌和非孢子真菌，因?yàn)樗鼈儾荒茉诶鋬龈稍锏膲毫ο麓婊?。在接種到新鮮培養(yǎng)基中之前，可以通過(guò)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基（細(xì)菌和藻類(lèi)）、含有細(xì)菌宿主（噬菌體）或水（真菌和酵母）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中再水化細(xì)胞沉淀來(lái)回收凍干培養(yǎng)物 

圖3 。 含有凍干微生物的安瓿。

如何使用微膠囊保存微生物？

微囊化，是指細(xì)胞在儲(chǔ)存前被包裹在基質(zhì)中，屬于一種長(zhǎng)期的微生物保存方法，此法避免了微生物長(zhǎng)期直接暴露于冷凍或干燥的嚴(yán)酷環(huán)境中。由于存在基質(zhì)保護(hù)細(xì)胞，增加儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性。當(dāng)在-80°C 下儲(chǔ)存時(shí)，益生菌在藻酸鈣中的微膠囊化已被證明可以提高它們的生存力。益生菌被包裹在納米纖維和液滴當(dāng)中可以保持較強(qiáng)活力。 

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