蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)常見問題原因分析匯總?cè)缦拢?/strong>
一、檢測(cè)無信號(hào)
主要可能由于以下原因?qū)е拢?/strong>
1. 用于檢測(cè)的二抗不匹配。解決辦法：需要確定一抗的宿主。
2. 一抗二抗的濃度過低：需要耐心地重新實(shí)驗(yàn)。
3.一抗不識(shí)別被檢測(cè)物種中的蛋白質(zhì)：可以再檢查以下一抗的特異性。
4.凝膠上上樣的蛋白量太少：凝膠上樣品過少也會(huì)導(dǎo)致信號(hào)弱，所以適當(dāng)增加樣本量也可以防止此現(xiàn)象發(fā)生。
5.傳輸效率相當(dāng)?shù)?/span>：出現(xiàn)這種情況可以嘗試修改轉(zhuǎn)移程序的操作，確保 PVDF 與甲醇預(yù)孵育。轉(zhuǎn)移后干燥 PVDF 以確保蛋白質(zhì)與疏水膜的結(jié)合。
6.一抗使用次數(shù)過多：億康如果過度稀釋對(duì)信號(hào)檢測(cè)也會(huì)有一定的影響，所以盡量使用新稀釋的一抗。
7.阻塞時(shí)間過長(zhǎng)或洗滌次數(shù)過多：盡量減少阻塞時(shí)間和洗滌時(shí)間。
8. 檢測(cè)試劑盒不起作用：這種情況出現(xiàn)的較少，實(shí)驗(yàn)中注意試劑盒的有效期是否正常，也可使用陽(yáng)性對(duì)照并確保檢測(cè)試劑盒正常工作。
9.NaN可能會(huì)抑制二抗：盡量避免在稀釋緩沖液中使用NaN。
10.一抗或二抗的孵育時(shí)間太短：可適當(dāng)延長(zhǎng)孵化時(shí)間
11. SDS 上樣緩沖液和樣品裂解液沒有充分混合或者混合不均勻： SDS 上樣緩沖液需要隨用隨配，以保證其新鮮度，另外緩沖液與裂解液可以使用渦旋混合器進(jìn)行充分混合。
二、無蛋白質(zhì)的區(qū)域具有高背景
蛋白免疫印跡常見問題中出現(xiàn)這種現(xiàn)象，可能由于以下幾種情況所導(dǎo)致。
1.可能由于封閉時(shí)間過短或封閉緩沖液使用不當(dāng)。大多數(shù)一抗基本不會(huì)和白蛋白或酪蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。如果任何沒有蛋白質(zhì)的區(qū)域具有高背景，則封閉步驟可能無法正常工作。
2.一抗或二抗的濃度過高所致：適當(dāng)降低抗體濃度。
3.洗滌不夠充分：可以增加洗滌的次數(shù)。
4.孵化溫度過高：一抗的孵育溫度以4°C左右為宜。
5.轉(zhuǎn)印膜選用不當(dāng)，或者轉(zhuǎn)印膜干燥：一般情況下選用PVDF膜具有較好的轉(zhuǎn)印效果，同時(shí)防止膜干燥。
6.較高分子量的高背景也有可能是由于還原試劑、SDS或樣品加熱方式時(shí)長(zhǎng)不正確。
三、出現(xiàn)白帶或信號(hào)迅速減弱
1.一抗或二抗過高：適當(dāng)降低抗體濃度
2.ECL 溶液被污染：注意保持ECL 溶液新鮮程度，或者使用新配制的 ECL 溶液。
3.混合后的 ECL 溶液壽命縮短：注意選擇合適的ECL 解決方案。
四、斷帶、特殊條帶出現(xiàn)
凝膠電泳期間使用的電壓過高或緩沖液溫度過高會(huì)出現(xiàn)這種情況。
五、出現(xiàn)漫反射帶
1.抗體濃度過高：適當(dāng)降低抗體濃度。
2.凝膠上上樣的蛋白質(zhì)量太高：盡量減少上樣量。
六、出現(xiàn)空白區(qū)域
這種情況多數(shù)是由于轉(zhuǎn)移不均勻所造成。轉(zhuǎn)移時(shí)需要確保膜在凝膠上均勻無氣泡。
七、非特異性信號(hào)
有的時(shí)候高濃度的抗體也導(dǎo)致非特異性信號(hào)出現(xiàn)。內(nèi)源性免疫球蛋白，尤其是在組織裂解物中 容易出現(xiàn)信號(hào)干擾?？梢酝ㄟ^預(yù)先清除內(nèi)源性免疫球蛋白來減少來自內(nèi)源性免疫球蛋白的非特異性信號(hào)。
八、條帶模糊或者出現(xiàn)污斑
這多數(shù)由于凝膠平衡時(shí)間不足或凝膠與膜接觸不均勻所致。
